Xét nghiệm PCR là gì?
Xét nghiệm PCR là một phương pháp trong phòng thí nghiệm được sử dụng trong sinh học phân tử và y học. Thử nghiệm này được sử dụng để phát hiện trực tiếp - và mô tả đặc tính - của vật liệu di truyền. Phương pháp PCR được các chuyên gia đánh giá là dễ thực hiện, có thể áp dụng phổ biến và hiệu quả.
Trong phòng thí nghiệm, xét nghiệm PCR bao gồm hai bước. Ở bước đầu tiên, vật liệu di truyền hiện có được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Điều này cho phép kiểm tra các dấu vết DNA nhỏ nhất. Đây cũng là lý do tại sao xét nghiệm PCR phản ứng rất nhạy cảm.
Trong bước thứ hai, vật liệu di truyền được tách ra theo đặc tính của nó, “sắp xếp” và từ đó được đặc trưng hóa. Nói cách khác, cấu trúc tinh tế của DNA được xác định.
Có rất nhiều ứng dụng khả thi: ví dụ, các bác sĩ sử dụng xét nghiệm PCR để kiểm tra sự hiện diện của virus Corona, hiến máu tìm HIV hoặc sàng lọc trẻ sơ sinh về các bệnh di truyền có thể xảy ra. Nhiễm trùng do vi khuẩn – ví dụ như mầm bệnh lao – hoặc nhiễm ký sinh trùng (sốt rét) cũng có thể được làm rõ bằng phương pháp PCR.
Chúng cũng giúp kết án thủ phạm trong pháp y dựa trên dấu vân tay di truyền của họ hoặc được sử dụng làm xét nghiệm quan hệ cha con.
Xét nghiệm PCR có hiệu lực trong bao lâu?
Kết quả xét nghiệm PCR thường có giá trị trong 48 giờ kể từ thời điểm lấy mẫu.
Độ tin cậy của xét nghiệm PCR như thế nào?
PCR là một phương pháp phát hiện đã được thử nghiệm và thử nghiệm trong chẩn đoán phân tử và y học. Nó được coi là tiêu chuẩn vàng với tỷ lệ lỗi rất thấp. Các xét nghiệm được đặc trưng bởi độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao.
Độ nhạy có nghĩa là độ tin cậy mà xét nghiệm tìm thấy vật liệu di truyền được phát hiện.
Tính đặc hiệu có nghĩa là độ chắc chắn mà xét nghiệm xác định rằng vật liệu di truyền được đề cập không có trong mẫu.
Khi nào xét nghiệm PCR có tác dụng đối với nhiễm trùng Sars-CoV-2?
Theo quy định, xét nghiệm PCR phát hiện nhiễm trùng hào quang từ hai đến ba ngày trước và tối đa 20 ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng. Ngay cả ở những người nhiễm bệnh hoàn toàn không có triệu chứng, xét nghiệm vẫn có hiệu quả trong khoảng thời gian quan trọng khi họ có thể lây nhiễm cho người khác.
Trong một số trường hợp riêng lẻ, thậm chí có thể phát hiện được sau 60 ngày kể từ khi xuất hiện triệu chứng.
Các nguồn lỗi có thể xảy ra
Tỷ lệ lỗi trong quá trình sao chép DNA trong thực tế là không đáng kể. Mặc dù DNA polymerase không bao giờ có lỗi nhưng chúng hầu như không đóng vai trò gì trong quy trình xét nghiệm PCR.
Trong thực tế, các nguồn sai sót tiềm ẩn chủ yếu nằm ở việc lấy mẫu: do đó, điều quan trọng là các chuyên gia y tế được đào tạo phải tiến hành lấy mẫu xét nghiệm. Các mẫu nước bọt và nước súc miệng có thể làm giảm độ chính xác của xét nghiệm vì hiệu ứng pha loãng xảy ra ở đây.
Xét nghiệm PCR hoạt động như thế nào?
Ví dụ, xét nghiệm PCR được thực hiện bởi bác sĩ gia đình hoặc tại các trung tâm xét nghiệm đặc biệt. Đầu tiên, các bác sĩ hoặc chuyên gia y tế được đào tạo sẽ lấy mẫu. Một miếng gạc thường được lấy từ đường hô hấp trên để xét nghiệm. Điều này thường có dạng ngoáy miệng hoặc ngoáy mũi họng.
Cũng có thể súc miệng bằng dung dịch súc rửa. Mẫu máu không phải là điển hình để phát hiện hào quang - nhưng được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc trẻ sơ sinh chẳng hạn.
Bất kể loại mẫu được lấy là gì, vật liệu di truyền đều được tìm thấy trên tăm bông, trong dung dịch rửa hoặc trong giọt máu. Vật liệu mẫu này được gửi đến phòng thí nghiệm, nơi nó được phân lập và tinh chế.
Sau đó, xét nghiệm PCR được chia thành hai bước:
- PCR: Trong bước này, số lượng vật liệu di truyền ban đầu được khuếch đại.
Bước 1: PCR – “Phản ứng chuỗi polymerase”
“PCR” là bước đầu tiên trong hai bước: Đây là bước khuếch đại lượng DNA ban đầu có sẵn. Điều này là do vật liệu di truyền chỉ có thể được phân tích khi nó có đủ số lượng. Trong hầu hết các trường hợp, đây là DNA của con người; trong trường hợp xét nghiệm tìm coronavirus, đó là RNA của virus.
PCR viết tắt là viết tắt của “phản ứng chuỗi polymerase”.
PCR cần những gì?
DNA ban đầu được đặt trong bình phản ứng với các chất đặc biệt. Vật liệu di truyền hiện có đóng vai trò như một khuôn mẫu, được sao chép với sự có mặt của một số enzyme (Taq polymerase) và các khối xây dựng DNA cơ bản nhất định.
Quá trình sao chép diễn ra theo nhiều lần chạy (chu kỳ) lặp đi lặp lại.
Cụ thể, các chất sau đây được thêm vào với nhau:
- DNA khởi đầu: Vật liệu mẫu sẽ được sao chép.
- Các khối xây dựng DNA cơ bản: Đây là các nucleobase adenine, thymine, cytosine và guanine.
- DNA polymerase: Một enzyme liên kết các khối xây dựng DNA riêng lẻ để tạo thành chuỗi DNA được xác định rõ. Sợi mới thu được là hình ảnh phản chiếu (bổ sung) của vật liệu ban đầu.
- Mồi: Chúng bao gồm 16 đến 24 cặp bazơ và đóng vai trò là vị trí bắt đầu và tín hiệu bắt đầu. Mồi chỉ ra DNA polymerase tại vị trí nào (của DNA ban đầu) quá trình sao chép bắt đầu.
Xét nghiệm PCR được thực hiện như thế nào?
Bây giờ tất cả các chất cần thiết cho PCR đều có trong bình phản ứng, quá trình sao chép thực sự của vật liệu di truyền có thể bắt đầu. Quá trình này được bắt đầu, kiểm soát và dừng lại chỉ bằng nhiệt độ.
Do đó, bình phản ứng lần lượt được làm nóng hoặc làm lạnh đến các nhiệt độ khác nhau. Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng một thiết bị đặc biệt được gọi là máy luân nhiệt. Toàn bộ phản ứng mất khoảng một đến hai giờ.
Các bước riêng lẻ của một chu trình PCR là
- Biến tính chuỗi kép DNA: Mẫu được đun nóng đến khoảng 90 độ C. Điều này tách chuỗi kép DNA ban đầu thành hai chuỗi đơn (bổ sung) riêng lẻ.
- Gắn lớp sơn lót: Nhiệt độ được hạ xuống dưới 60 độ C một chút. Điều này làm cho các mồi (mồi tiến, mồi ngược) gắn vào các vị trí xác định trên từng sợi DNA riêng lẻ tương ứng.
Sau khi hoàn thành một chu trình, nhiệt độ lại tăng lên khoảng 90 độ C – chu trình bắt đầu lại từ đầu.
Phương pháp PCR có thể được sử dụng để khuếch đại các chuỗi DNA lên tới khoảng ba cặp kilobase (kbp). Điều này tương ứng với khoảng 3,000 khối xây dựng DNA cơ bản được liên kết với nhau để tạo thành một “chuỗi”. Để so sánh: bộ gen của con người lưu trữ các bản thiết kế và thông tin về hoạt động của tế bào trong khoảng ba tỷ cặp bazơ – mặt khác, bộ gen của virus corona bao gồm 30,000 cặp bazơ. Do đó, xét nghiệm PCR chỉ có thể khuếch đại và kiểm tra các phần ngắn của tổng số DNA.
Lớp sơn lót rất quan trọng
Việc lựa chọn mồi là rất quan trọng đối với quy trình PCR. Ví dụ, trong chẩn đoán Sars-CoV-2, một số mồi được sử dụng (PCR đa kênh).
Do đó, xét nghiệm Corona PCR tìm kiếm ba gen virus khác nhau: Điều này làm tăng độ đặc hiệu tổng thể lên gần 99.99%. Điều này có nghĩa là với tỷ lệ trúng đích cao này, chỉ có một xét nghiệm dương tính giả trên 10,000 xét nghiệm (nếu lấy mẫu đúng).
Hiện nay có bao nhiêu vật liệu di truyền được sao chép?
Giả sử rằng có hai chuỗi kép DNA giống hệt nhau xuất hiện sau chu kỳ đầu tiên.
Sau mỗi chu kỳ, lượng vật chất di truyền (được sao chép) tăng gấp đôi. Số lượng DNA do đó tăng theo cấp số nhân.
Các bác sĩ thường lặp lại quá trình này khoảng hai mươi đến ba mươi lần.
Nói một cách hình tượng, điều này có nghĩa là ngay cả khi chỉ tìm thấy một chuỗi kép DNA duy nhất trong mẫu lúc đầu, thì sau hai mươi chu kỳ đã có hàng triệu bản sao giống hệt nhau trong bình phản ứng.
Giá trị Ct có ý nghĩa gì?
Số chu kỳ PCR được thực hiện được biểu thị dưới dạng giá trị Ct. “Ct” có nguồn gốc từ thuật ngữ tiếng Anh “ngưỡng chu kỳ”. Giá trị Ct này giúp đưa ra nhận định về lượng vật liệu di truyền đang được tìm kiếm.
Với giá trị Ct thấp là 20, có rất nhiều vật chất di truyền ban đầu. Tuy nhiên, nếu giá trị Ct cao – khoảng 30 chu kỳ – tương ứng sẽ có ít DNA. Do đó, chu trình PCR phải được chạy thường xuyên hơn.
Bước 2: Điện di “Phân loại theo kích thước”
Khi đã có đủ vật liệu di truyền “được làm giàu”, phương pháp điện di có thể được thực hiện. Trong quá trình này, các nhà khoa học khai thác một đặc tính cụ thể của DNA: điện tích của nó.
Các khối xây dựng DNA riêng lẻ được liên kết với nhau thông qua đường trục phốt phát đường (tích điện âm). Một chuỗi DNA cụ thể càng dài thì điện tích của nó càng cao.
Điều này cho phép vật liệu di truyền được kiểm tra và mô tả. Trong thực tế, một mẫu chưa biết thường được vẽ dựa trên một tham chiếu đã biết trên “vạch xuất phát” và được so sánh với nhau sau một khoảng thời gian nhất định.
Nếu “tốc độ di chuyển” là như nhau cho cả hai chuỗi, điều này có nghĩa là kết quả phát hiện rất có thể là dương tính: Việc phát hiện rất có thể là dương tính – gen bạn đang tìm kiếm có trong mẫu.
Trường hợp đặc biệt của virus Corona: chuẩn bị mẫu và RT-PCR
Việc phát hiện virus Corona là một trường hợp đặc biệt. Sars-CoV-2 là một trong những loại virus được gọi là RNA. Điều này có nghĩa là vật liệu di truyền Sars-CoV-2 hiện diện ở dạng RNA (axit ribonucleic).
RNA chỉ khác với DNA ở một số khía cạnh. Trong số những thứ khác, nó hiện diện dưới dạng một chuỗi đơn và dựa trên đường ribose thay vì 2′-deoxyribose. nucleobase thymine cũng được thay thế bằng uracil làm bazơ thứ tư.
RNA virus này phải được “phiên mã” thành DNA trước khi tiến hành xét nghiệm PCR thông thường. Quá trình này được gọi là phiên mã ngược (RT) – do đó có thuật ngữ RT-PCR. Một chuỗi cDNA (“DNA bổ sung”) được thu được như một phần của quá trình này. Trong bước tiếp theo, chuỗi đơn cDNA được bổ sung bằng chuỗi DNA thứ hai, hình ảnh phản chiếu.
Mất bao lâu để có được kết quả?
Sau khi mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm, bạn thường sẽ nhận được kết quả trong vòng một hoặc hai ngày làm việc. Tại các trung tâm kiểm tra, nơi thường kiểm tra mẫu trực tiếp tại chỗ, quá trình này cũng có thể chỉ mất vài giờ. Khoảng thời gian phụ thuộc phần lớn vào trung tâm khảo thí tương ứng và dịch vụ hậu cần của nó.
Mặc dù quy trình làm việc phức tạp nhưng các phòng thí nghiệm hiện đại vẫn có thể thực hiện các xét nghiệm PCR với hiệu suất cao. Các thiết bị tự động đặc biệt giúp thực hiện các bài kiểm tra.
Tuy nhiên, xét nghiệm PCR được coi là phương pháp phát hiện tương đối “chậm” nhưng đáng tin cậy hơn.
Điều gì xảy ra nếu kết quả là dương tính?
Nếu mẫu được lấy chính xác, kết quả xét nghiệm PCR dương tính có nghĩa là có khả năng rất cao người được xét nghiệm bị nhiễm Sars-CoV-2.
Nếu bạn đã được xác nhận là nhiễm vi-rút Corona bằng xét nghiệm PCR, bộ y tế công cộng sẽ nhận được thông báo về kết quả xét nghiệm dương tính từ phòng thí nghiệm liên quan. Trong trường hợp như vậy, bộ y tế công cộng sẽ ra lệnh cách ly hoặc cách ly.
Tôi có tự động lây nhiễm không nếu tôi xét nghiệm PCR dương tính?
Thường thì có. Nhưng không phải lúc nào cũng vậy. Kết quả xét nghiệm PCR phải luôn được giải thích theo ngữ cảnh. Kết quả xét nghiệm dương tính trước hết có nghĩa là bạn đang mang vật liệu chứa vi-rút.
Xét nghiệm kháng thể bổ sung đôi khi hữu ích
Trong những trường hợp như vậy, xét nghiệm kháng thể mang lại sự chắc chắn xác nhận tính hợp lệ của xét nghiệm PCR. Tốt nhất là thảo luận điều này với bác sĩ của bạn. Họ có thể giúp bạn diễn giải kết quả xét nghiệm PCR một cách chính xác.
Phải làm gì nếu kết quả âm tính?
Kết quả xét nghiệm PCR âm tính rất có thể có nghĩa là bạn không nhiễm Covid-19 tại thời điểm lấy mẫu và do đó hiện không có khả năng lây nhiễm. Tuy nhiên, bạn có thể đang ở giai đoạn nhiễm trùng sớm.
Nhiễm trùng Corona thường chỉ có thể được phát hiện từ ngày thứ hai hoặc thứ ba sau khi nhiễm bệnh. Do đó, kết quả không phải là một đường chuyền miễn phí. Do đó, bạn nên tiếp tục tuân thủ các quy tắc vệ sinh và giãn cách xã hội, đồng thời tiếp tục đeo khẩu trang FFP2 - để bảo vệ chính bạn và người khác.
Xét nghiệm PCR cho trẻ em
Xét nghiệm PCR cho trẻ em không khác gì xét nghiệm PCR cho người lớn. Cả việc lấy mẫu và giải thích kết quả đều áp dụng cho trẻ em cũng như người lớn.
Rủi ro của xét nghiệm PCR là gì?
Xét nghiệm PCR không liên quan đến bất kỳ rủi ro vật lý nào. Chỉ có việc lấy mẫu bằng tăm bông ngoáy mũi họng mới được một số người cho là đáng lo ngại hoặc khó chịu.
Chi phí xét nghiệm PCR là bao nhiêu?
Xin lưu ý: Nếu bạn đã tự xét nghiệm tại nhà và nhận được kết quả dương tính, bạn nên đặt lịch hẹn với bác sĩ gia đình ngay qua điện thoại. Bác sĩ sẽ thảo luận các bước tiếp theo với bạn qua điện thoại.
Ngoài ra, tốt nhất bạn nên gọi tới số 116 117 để đăng ký xét nghiệm PCR. Tốt nhất, bạn nên ở nhà cho đến khi có kết quả kiểm tra xác nhận để bảo vệ bản thân và những người khác.
